BL21(AI)感受態(tài)細(xì)胞

產(chǎn)品規(guī)格CAT#: BFNC86069-01(10×100ul)/BFNC86069-02(50×100ul)

BL21(AI)：                                                   100μl/支

pUC19 (control vector，10pg/μl):                    10μl

保存條件(保質(zhì)期)：                             -80℃（6個(gè)月）

基因型

F^- ompT hsdS_B(r_B^-m_B^-) gal dcm araB::T7RNAP-tetA

產(chǎn)品說明

BL21(AI)是大腸桿菌B/r型菌株(E.coli B/r)。BL21(AI) 來源于BL21菌株，為Lon蛋白酶和膜外蛋白酶OMPT的缺陷型菌株，這兩種酶的缺失有效防止異源蛋白在大腸桿菌體內(nèi)的降解。在培養(yǎng)基中添加L-阿拉伯糖可誘導(dǎo)araBAD啟動(dòng)子下游T7RNA聚合酶的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)目的蛋白的表達(dá)。在培養(yǎng)基中添加葡萄糖可抑制araBAD啟動(dòng)子下游T7RNA聚合酶的表達(dá)進(jìn)而抑制目的蛋白的表達(dá)。BL21(AI) 感受態(tài)細(xì)胞適用于任何以T7啟動(dòng)子為基礎(chǔ)的表達(dá)載體，能夠進(jìn)行高水平的重組蛋白表達(dá)。因?yàn)榫昴軌驅(qū)w內(nèi)的T7 RNA聚合酶水平進(jìn)行高效調(diào)節(jié)，BL21(AI) 感受態(tài)細(xì)胞能夠表達(dá)對(duì)其他BL21細(xì)胞有毒性或抑制生長的蛋白。普通重組蛋白在BL21(AI) 菌株中獲得產(chǎn)量和其他BL21菌株產(chǎn)量相當(dāng)；對(duì)大部分毒性蛋白，在BL21(AI) 菌株中獲得的產(chǎn)量高于BL21(DE3)pLysS菌株或BL21(DE3)菌株。

青旗生物生產(chǎn)的BL21(AI) 感受態(tài)細(xì)胞由特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率高達(dá)10⁸cfu/μg DNA。

BL21(AI)感受態(tài)細(xì)胞

操作方法

1.  BL21(AI)感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA（質(zhì)粒或連接產(chǎn)物）并用手bo打EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

3. 向離心管中加入700μl不含抗生素的無菌培養(yǎng)基（2YT或LB），混勻后37℃，200rpm復(fù)蘇60分鐘。

4. 5000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含抗生素的2YT 或LB培養(yǎng)基上。

5. 將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

注意：

1. Brian Caliendo (Voigt 實(shí)驗(yàn)室)報(bào)道過pCP20質(zhì)粒比較難于轉(zhuǎn)化到這個(gè)感受態(tài)細(xì)胞中，而pCP20轉(zhuǎn)化到其他菌株中都很正常，但是菌體原因未知。

2. 不加葡萄糖，BL21(AI) 細(xì)胞的araBAD啟動(dòng)子下游的本底蛋白表達(dá)水平仍然很低，加入葡萄糖后能夠進(jìn)一步的降低本底蛋白的表達(dá)水平。

IPTG

Prepare a 1 M solution of IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside / thiogalactopyranoside) by dissolving 2.38 g of IPTG in dd water and adjust the final volume to 10 ml. Filter sterilize before use.

注意事項(xiàng)

1. 感受態(tài)細(xì)胞盡量在冰中緩慢融化，插入冰中8分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA，不可在冰中放置時(shí)間過長，長時(shí)間存放會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

2. 混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作。

3. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少終用于涂板的菌量。

4. 誘導(dǎo)時(shí)，IPTG濃度可選（0.1-2mM均可）。

5. 為獲得需要量的蛋白，誘導(dǎo)時(shí)間，溫度，IPTG濃度需實(shí)驗(yàn)者優(yōu)化。

建議選擇該菌株進(jìn)行蛋白表達(dá)的條件如下：

1. 使用T7啟動(dòng)子載體（高拷貝或者低拷貝都可以）進(jìn)行蛋白表達(dá)。

2. 使用其他BL21菌株進(jìn)行蛋白表達(dá)時(shí)，觀察到明顯的細(xì)菌生長的抑制作用。

3. 表達(dá)一個(gè)已知的毒性蛋白。