OrigamiB(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞

產(chǎn)品規(guī)格CAT#: BFNC86079-01(10×100ul)/BFNC86079-02(50×100ul)

OrigamiB(DE3)pLysS：                               100μl/支

pUC19 (control vector，10pg/μl):                    10μl

保存條件(保質(zhì)期)：                             -80℃（6個(gè)月）

基因型

F^-ompT hsdS_B(r_B^-m_B^-) gal dcm lacY1 ahpC (DE3) gor522::Tn10 trxB (Kan^R,Tet^R) pLysS Cam^R

產(chǎn)品說(shuō)明

Origami B (DE3) pLysS菌株攜帶pLysS質(zhì)粒，具有氯霉素抗性。pLysS可表達(dá)T7溶菌酶（T7溶菌酶可以作用于大腸桿菌細(xì)胞壁上的肽聚糖溶解大腸桿菌，還可與T7 RNA聚合酶結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而降低目的基因的背景表達(dá)水平，但不干擾IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)），適合表達(dá)毒性蛋白和非毒性蛋白。Origami B (DE3) pLysS菌株表達(dá)突變的硫氧還蛋白還原酶 (thioredoxin reductase) (trxB)和谷胱甘肽還原酶 (glutathione reductase) (gor)，這兩個(gè)酶是還原途徑的關(guān)鍵酶，突變后有利于形成正確折疊的含有二硫鍵的蛋白，增強(qiáng)蛋白的可溶性。 此外，該菌株染色體整合了λ噬菌體DE3區(qū) (DE3區(qū)含有T7噬菌體RNA聚合酶)，可同時(shí)表達(dá)T7 RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶，可用于pET系列，pGEX，pMAL等質(zhì)粒的蛋白表達(dá)，具有氯霉素、卡那霉素和四環(huán)素抗性，不能用于具有氯霉素，卡那霉素抗性質(zhì)粒的表達(dá)。

青旗生物生產(chǎn)的Origami B (DE3) pLysS感受態(tài)細(xì)胞由特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率達(dá)10⁸ cfu/μg DNA。

操作方法

1. Origami B (DE3) pLysS感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的質(zhì)粒，并用手bo打EP 管底混勻，冰中靜置25分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰中并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

3. 向離心管中加入700 μl不含抗生素的無(wú)菌培養(yǎng)基 (2YT或LB)，混勻后37℃，200 rpm復(fù)蘇60分鐘。

4. 5000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。

5. 將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。

OrigamiB(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞

IPTG配制：

Prepare a 1 M solution of IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside; Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) by dissolving 2.38 g of IPTG in dd water and adjust the final volume to 10 ml. Filter sterilize before use.

氯霉素配制

Chloramphenicol  34 mg/ml in ethanol. Store at -20℃. Use at 34 µg/ml.

注意事項(xiàng)

1. 感受態(tài)細(xì)胞盡量在冰中緩慢融化，插入冰中8分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA，不可在冰中放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間存放會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

2. 混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作，轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少終用于涂板的菌量。

3. 誘導(dǎo)時(shí)，IPTG濃度可選（0.1-2 mM均可）。

4. 為獲得需要量的蛋白，誘導(dǎo)時(shí)間，溫度，IPTG濃度需實(shí)驗(yàn)者優(yōu)化。

5. 具有氯霉素，卡那霉素和四環(huán)素抗性，不能用于具有氯霉素，卡那霉素和四環(huán)素抗性質(zhì)粒的表達(dá)。